自己を用いた覚醒マウスの脳血流の動的3Dイメージング

Communications Biology volume 6、記事番号: 298 (2023) この記事を引用

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脳血流（CBF）は脳機能を評価するために広く使用されています。 しかし、ほとんどの前臨床CBF研究は麻酔下で行われており、所見が混乱しています。 覚醒している動物の高時空間分解能 CBF イメージングは​​、特にドップラーベースのフロー イメージングの場合、モーション アーティファクトとバックグラウンド ノイズにより困難です。 今回我々は、効果的な画像ノイズ除去とモーションアーティファクト除去のための自己教師あり深層学習を開発することにより、覚醒マウスのCBF速度（CBFv）ダイナミクスの3Dイメージングのための超高解像度光コヒーレンスドップラー断層撮影法（µODT）を報告します。 我々は、覚醒マウスと麻酔マウスの皮質CBFvと、神経血管毒性と関連する中毒性の高い薬物である急性コカイン（1 mg/kg、静注）に対する細動脈、静脈、毛細血管ネットワークの動的応答を比較します。 覚醒時と比較して、イソフルラン (2 ～ 2.5%) は血管拡張を誘発し、2 ～ 4 分以内に CBFv を増加させますが、デクスメデトミジン (0.025 mg/kg、腹腔内) は血管の直径も流れも変化させません。 急性コカインはデクスメデトミジンおよび覚醒状態でCBFvを同程度減少させるが、イソフルラン下では減少がより大きく、イソフルラン誘発血管拡張がコカイン誘発血管収縮の検出を容易にした可能性があることを示唆している。 慢性コカイン後に覚醒したマウスは、重度の血管収縮、CBFvの減少、および深部の皮質毛細血管への血液供給を優先する拡張された潜行細動脈/静脈血管による血管適応を示します。 私たちが提示する 3D イメージング プラットフォームは、覚醒した動物の脳内の CBFv ネットワークと並行して血管の直径と形態の動的な変化を研究するための強力なツールを提供し、薬物や疾患状態 (虚血、腫瘍、創傷治癒) の影響についての理解を進めることができます。

脳血流（CBF）は、神経血管結合を介してシナプス活動をサポートするために必要なエネルギー供給を維持するために重要です。 したがって、CBF は他の血行動態測定と併せて、機能的 MRI (fMRI) の血中酸素化レベル依存性 (BOLD) シグナルをニューロンやアストロ サイトからの細胞レベルの活動に結び付けるために使用されてきました 1,2。 しかし、実験動物の生体内脳血管イメージングのための現在の技術は、主にイメージング深度と時空間分解能の間のトレードオフによって妨げられています。 これらには、細動脈や細静脈までの単一血管分解能と、脳活性化によって引き起こされる脳血液量 (CBV) および BOLD 変化を分解する高速時間分解能を備えた高磁場 fMRI 3、毛細血管分解能に近い経頭蓋深部血管イメージングのためのマイクロバブルベースの超音波顕微鏡が含まれます。赤血球速度 (vRBC)4 の高速追跡、および空間分解能に応じて 3 mm を超える拡張深さで微小血管構造を視覚化するための長波長近赤外 (NIR-II、たとえば >1 μm) 蛍光イメージングと、感度5、6。 光音響顕微鏡 (PAM) を使用すると、毛細血管床の 3D ラベルフリー微小血管イメージングと、マウス皮質の深さ約 0.8 mm のこれらの血管内のヘモグロビン酸素化状態のマッピングが可能になります7。 多光子蛍光顕微鏡は、マウス皮質の深さ 1.6 mm の 3D 毛細管ネットワークを分解するための優れた空間分解能と画像コントラスト、および毛細管を流れる蛍光染色された RBC (フラックス) を計数することによって vRBC を測定することができます 8,9,10。 超高解像度の光コヒーレンスアンギオグラフィー（μOCA）およびドップラー断層撮影法（μODT）は、毛細管分解能を備えた微小血管系およびCBF速度（CBFv）ネットワークの3Dイメージングをより詳細に（細動脈、細静脈、毛細管の流れのネットワークなど）、マウス皮質の表面から 1.2 ～ 1.6 mm の深さ 11、12、13、14。 µODT はまた、細動脈または毛細血管のレーザー破壊に対する微小循環 CBFv ネットワーク応答の捕捉、およびコカイン誘発性の皮質微小虚血、血管破壊、血管新生、適応の検出における感度と分解能を実証しました。これらはすべて、その比較的広いフィールドによって可能になります。視野の広さと高い時空間解像度15、16、17。

コカインの誤用は、脳卒中、出血、一過性脳虚血発作などの生命を脅かす神経合併症のリスクを高めます。 コカイン誘発性脳卒中の約 25% ～ 60% は、脳血管けいれんと虚血に起因すると考えられます 18、19、20、21。 血管収縮は虚血の原因因子の中で重要な役割を果たしていると考えられます19、22、23。 実際、急性コカイン攻撃後の脳血管収縮は、ヒトにおいて血管造影により記録されている 22,24。 脳画像研究では、コカイン乱用者 24,25 および動物の脳 26,27 における脳血流 (CBF) と血液量 (CBV) の顕著な減少が記録されています。 脳の報酬に対するコカインの影響に関するPETやMRIなどの画像技術から得られる知識の進歩にもかかわらず、生体内での脳血管ネットワークに対するコカインの急性および慢性の影響についてはあまり知られていません。 当社の 3D µODT は、赤血球を移動させて CBFv を画像化する固有のドップラー効果を測定し、造影剤の必要性を回避します。 これは、コカイン暴露の縦断画像研究にとって非常に望ましいことです。 当社の µODT は、動脈、静脈、毛細血管にわたる 3D CBFv ネットワーク イメージング 28 と、さまざまな皮質層における脳の活性化に対するそれらの応答を可能にします。 3D µOCA/µODT は、(1) 定量的、(2) ラベルフリー、(3) 高速感度 (<20 µm/s)、(4) 高い空間分解能 (<6 µm)、および (5) ）比較的大きな皮質容積（例、3 × 2.4 × 1.5 mm3）を迅速にカバーすることができます。

しかし、微小血管系の前臨床研究のほとんどは麻酔下で行われており、細胞（ニューロン、アストロサイトなど）の活動や脳の血行動態（CBF、酸素化の変化など）に麻酔薬による混乱が生じる29、30、31。 同様に、実験動物における脳血流に対するコカインの影響に関する研究のほとんどは麻酔下で行われており、コカインに対する生理学的反応に影響を与える可能性があります30,32。 したがって、覚醒した動物の画像化を目的とした神経画像化研究が開始されています2,30,33,34,35。これは、特に 3D µOCA などのドップラーベースのフロー イメージング技術の場合、高解像度画像取得のパフォーマンスを危険にさらす可能性があるモーション アーティファクトのため困難です。 /μODT36、37、38。 この課題に取り組むために、ここでは、自己教師あり深層学習手法を組み込んだフローイメージングプラットフォーム（例：μODTセットアップ、モバイルケージ、頭蓋窓）を最適化し、覚醒行動マウスからのモーションアーティファクトを効果的に低減し、3D画像の違いを比較します。覚醒状態と麻酔状態（例、イソフルラン、デクスメデトミジン、ケタミン）における感覚運動野の微小血管系（μOCA）と定量的CBFvネットワーク（μODT）。 これらの技術を適用して、覚醒状態と麻酔状態の間での急性コカインに対する脳血管反応の違いを測定し、覚醒状態のマウスで測定した場合の慢性コカイン曝露の影響を評価します。

ドップラーベースの血流検出モダリティの場合、脳微小血管系および CBFv ネットワークの高解像度イメージングは​​、動きによって引き起こされるノイズやアーチファクトに対して非常に敏感です。 麻酔をかけた動物を対象としたこれまでの in vivo イメージング研究とは異なり、覚醒した動物の 3D µOCA および µODT は非常に困難です。 この課題に取り組むために、私たちは効果的なノイズ除去とモーション アーティファクトの除去のために、OCT プラットフォームの最適化と自己教師あり学習を組み合わせた戦略を実装しました。 OCT プラットフォームの最適化には、(1) A スキャン レートの最適化と、毛細管流検出に十分な感度を維持しながら高速イメージング レートを優先するポイント、(2) 振動ノイズを最小限に抑えるためのプローブの小型化、(3) カスタムの短く剛性の高い動物を使用した動物の動きの低減が含まれます。マウント (例: Ti ヘッド プレート、エアフローティング カーボン ケージ、動物用トレッドミルの事前トレーニング)。 図 1 は、OCT スキャン ヘッドの再設計と動物の訓練前後の、覚醒マウスの感覚運動野における 2 つのグループの代表的な µOCA/µODT 画像を比較しています。 左側のパネルは、麻酔をかけた動物研究用に当社の OCT スキャナーで取得した 13 もので、黄色の矢印で強調表示されている激しい運動誘発性の縞模様と、μOCA 画像 (a) の微小血管系の全体的な高いノイズとぼやけ、および運動アーティファクト (水色の矢印) と過度のノイズを示しています。 µODT 画像のバックグラウンド ノイズ (c)。 一方、OCT スキャン ヘッドの再設計と動物のトレッドミル トレーニングの後、右のパネルでは、μOCA 画像 (b) および麻酔をかけた動物のものと同等の高忠実度の μODT 画像 (d) における縞模様の動きアーティファクト、ぼやけおよび背景ノイズが大幅に減少していることがわかります。 補足ビデオ SV1 と SV2 は、頭を拘束したマウスのトレッドミル トレーニング前後の動きの違いを示しています。 訓練されていないマウスは、セッション全体を通じて非常に活発で頻繁に動きましたが、訓練後は穏やかになり、訓練前よりも動きが大幅に減りました。 興味深いことに、毛細管 CBFv ネットワークの µODT イメージングは​​一般に運動誘発性の位相ノイズの影響を受けやすいにもかかわらず、図 1 は、覚醒している動物では運動の影響 (縞模様のアーティファクトやノイズなど) が µODT よりも µOCA でより深刻であることを示しています。 これは、µODT を再構成するための 2 つの隣接する A スキャン間の持続時間 (たとえば、ΔtµODT ≈ 2.3 ms) が、µOCA を再構成するための 2 つの隣接する B スキャン間の持続時間 (たとえば、ΔtµOCA ≈ 0.21 秒) よりも短いためであると考えられます。 μOCA 取得の継続時間が長い (ΔtμOCA ≈ 100ΔtμODT) と、動きによる画像劣化がさらに深刻になりました。 さらに、図1c、dのようにμODT画像は角度補正されていないため（つまり、光の入射と流れの方向の間の余弦角）、一部の分岐流は血管系に沿って不均一に見える可能性があります28。 より詳細な分析は補足ノート S1 に記載されています。

左パネル: 以前に報告された OCT スキャナーで取得された μOCA (a) および μODT (c) 画像。 右パネル: 動物訓練後に再設計された OCT スキャナーで取得された対応物 (b、d)。 黄色と水色の矢印は、それぞれμOCA画像とμODT画像のモーションアーティファクトを示しています。 画像サイズ：2.3×1.2×2mm3。

図1に示すように、運動誘発性の位相ノイズとアーティファクトは、覚醒している動物の神経血管イメージング、特にμOCAの場合に大きな課題となっています。 OCT スキャン ヘッドの最適化と覚醒した動物のトレーニングに加えて、深層学習モデリング 39,40,41 を含むさまざまな画像処理手法を実装し、モーション アーティファクトを最小限に抑え、μOCA および μOCA 画像のノイズを除去する自己教師あり学習モデルを開発しました (「方法」を参照)詳細なフレームワークについては)。 図 2 は、動きによって引き起こされるアーチファクト (縞模様やそれに伴う微小血管のぼやけなど) を低減するための深層学習ベースの画像処理の結果を例示しています。図 2a は生の µOCA データセットから投影された MIP 画像であり、図 2b は図 2b です。深層学習セグメンテーションによって図 2a から導出された 2 値化された血管性マスクです。 図 2c は、図 2a を図 2b でマスキングして強化した µOCA 画像であり、バックグラウンド ノイズが大幅に減少し、微小血管ネットワークが明確に回復していることがわかります。 深層学習フレームワークの有効性は、ストライプ状のアーティファクト (黄色の矢印で強調表示) がすべて除去されていることから明らかです。 下のパネル（図2d、e）は、動きに起因する位相ノイズバックグラウンドをノイズ除去する前後のμODT画像を比較しています。 図2の結果は、深層学習ベースの画像処理により、覚醒している動物からの運動誘発ノイズとアーティファクトが最小限に抑えられ、微小血管ネットワークとCBFv変化のより正確な定量的特性評価が可能になることを示しています。

黄色の矢印 (a) は、深層学習ベースの画像処理 (c) によって除去された μOCA のモーション アーティファクトを指します。ベッセルネス マスク (b) は、モーション アーティファクトを除去するための自己教師あり学習から導出されています。 下のパネルは、生の μODT 画像 (d) が自己教師あり学習によって効果的にノイズ除去されたこと (e) を示しています。 画像サイズ 2.3 × 1.2 × 2 mm3。

技術的な課題（動きによるアーチファクトなど）のため、ほとんどの生体内脳画像研究は麻酔をかけた動物で行われてきました。 しかし、麻酔効果は、電気刺激または薬理学的刺激に対する脳の機能的反応と、それに伴う脳血管の変化を混乱させます。 実際、図 3 の対応する分枝血管 (赤/青のバー: 細動脈/細静脈血管) の視覚的な比較は、イソフルラン (Iso) によって誘発された血管拡張を示しています。 図3eの統計分析は、毛細血管密度により血管直径が細動脈で44.6％±4.2％（p * < 0.001、m = 8血管）、細静脈で28.2％±5.0％（p * < 0.001、m = 8）増加したことを示しています。変化はありませんでした (-0.5% ± 0.4%、p = 0.3、m = 8)。 血管拡張に加えて、図4は、覚醒状態（a）とIso状態（b）のCBFvネットワークの3D μODTとその比画像（c）を示しています。 ΔμODT = [μODT(b)-μODT(a)]/μODT(a)図６はイソフルランによるＣＢＦｖの増加を示しており、赤と青の色はそれぞれＣＢＦｖの増加と減少を示している。 覚醒状態から Iso 麻酔状態への移行における流れのダイナミクスを追跡するために、図 4a の青い点線のボックスで強調表示されている 2.3 × 0.3 × 1.2 mm3 の小さなパネルを選択して、タイムラプス 3D μODT スタック（約 2 分/図4dに示すように立方体）、および図4eの比率画像は、2つの動脈アーケード、つまり図4aの2つの黄色の矢印を除いて全体的なCBFvの増加を示しました。 選択した16本の血管に基づいて、図4fは、個々の血管の流れの変化ΔCBFv（t）（破線のトレース）と、それらの平均変化（例えば、細動脈、細静脈および毛細管の流れについての実線の赤、青、および緑のトレース）をプロットします。 太字の黒色のトレースは、イソフルラン吸入後に t = 0 分で増加し、t ≈ 4 分で頭打ちとなった全体的な流量変化を表します (例、50% ± 12.9% 増加; p = 0.0003、m = 16)。 細動脈流量 (AF) と細静脈流量 (VF) は両方とも 70% 以上増加しました (AF: 70.9% ± 23.1%、p = 0.02; VF: 72.0% ± 20.9%、p = 0.01)。 その後、AFは比較的安定したままでしたが（例、57.8％±24.6％、p = 0.05、m = 6）、VFは徐々に22.6％±10.56％（p = 0.03、m = 4）に減少しました。 毛細管流量 (CF) の変化はより多様で、150% 以上の増加と -82% 以上の減少で、合計 29.5% ± 22.8% の増加となりました (p = 0.004、m = 6)。 動物全体の定量化が図4gに含まれており、平均ΔCBFがイソフルラン誘導後32.75％±5.65％増加したことを示しています（t = 20〜30分、ROI = 8/動物、n = 7マウス）。これは正規化されたベースラインよりも高いです覚醒状態では (0.01% ± 6.35%、t = −6–0 分、p* = 0.02)。

a、b 覚醒状態と Iso 状態の生の μOCA 画像。 c、d 深層学習処理により強化された対応するμOCA画像。 e 細動脈血管 (AV)、細静脈血管 (VV)、および毛細血管密度 (CD) におけるイソフルラン誘発血管拡張の統計分析。 画像サイズ：2.3×1.2×2.5mm3 赤と青のバーは細動脈および細静脈の血管サイズの変化 (Δ\({{{{\rm{\phi }}}}}\)) を表し、緑のバーは Iso による毛細血管密度の変化 (ΔD) を表します。

a、b 覚醒状態と Iso 状態の生の μODT 画像とその比率画像。 c 画像サイズ: 2.3 × 2.5 × 1.2 mm3); d、e 覚醒時からIso麻酔までのタイムラプス画像μODT（t）および比変化ΔμODT（画像サイズ：2.3×0.3×1.2mm3）。 f ISO 誘導性 CBFv が増加します。 動物間の覚醒状態（t：-8〜0分）とIso麻酔（t：20〜30分）の間の平均ΔCBFvの比較（p * = 0.02、m = 8 RoI/動物、n = 7マウス）。

同様に、覚醒状態とデクスメデトミジン (Dex) 麻酔状態を比較しました。 Dex は神経生理学的干渉が少ないと報告されているため、動物の脳機能研究にますます好まれています 42,43。 Iso で観察された血管拡張 (図 3) とは異なり、図 5 の 3D μOCA 画像では、Dex 誘導 (0.025 mg/kg、腹腔内) 後の血管拡張または血管収縮は示されませんでした。 図5cの定量的分析は、血管サイズに有意な変化がないことを示しています。たとえば、細動脈血管（AV）：-0.3％±0.7％（p = 0.67、m = 10）、細静脈血管（VV）：-0.1％ ± 0.6% (p = 0.71、m = 16)、毛細管密度 (CD): −0.41% ± 0.3% (p = 0.29、m = 5)。 図6は、覚醒状態（a）とDex状態（b）のCBFvネットワークの3D μODTとその比画像（c）を示しています。これにより、Dex麻酔下での細動脈と細静脈の増加と減少の両方を含む、小さな散在した流れの変化が明らかになりました。 図6d、eのタイムラプス3D μODTとその比率画像は、図6aの選択されたROI（破線のボックス）における覚醒状態からDex麻酔状態への移行における流れの変化を示しています。 図6fは、個々の血管における相対的な流れの変化（破線のトレース、n = 20）と、細動脈、細静脈、および毛細血管コンパートメントの平均CBFv変化をプロットしています。 Dex による全体的な流量変化 (太字の黒のトレース) を比較した一元配置分散分析 (ANOVA) では、時間 t = 0 分から 36 分 (F(15, 288) = [1.26]、p) にわたって有意な差がないことが明らかになりました。 = 0.23、n = 6 匹)。 血管タイプごとの個別の分析では、動脈血流量が t ≥ 9 分で -10.5% ± 2.61% (p = 0.01、n = 6) まで徐々に減少することが示されました。 t ≥ 16 分で、細静脈流量は -14.8 ± 3.76% (p = 0.03、n = 5) に減少しましたが、毛細血管流量の変化は多様で、62% 以上の増加と -16% 以上の減少があり、合計 6.3% ± 10.1% (p = 0.6、n = 8)。 図6gの動物全体の定量化により、覚醒状態またはベースライン（0.01％±6.21％、t = -8〜0分）とDex麻酔後（-10.28％±4.98％、t = 20〜30）の間で有意なΔCBFの変化がないことが明らかになりました。分、ROI = 8/動物、n = 3 匹、p = 0.24)。

a、b 覚醒状態と Dex 状態の生の μOCA 画像。 c、d 深層学習処理により強化された対応するμOCA画像。 e 細動脈血管 (AV)、細静脈血管 (VV) および毛細血管密度 (CD) における Dex 誘発のサイズ変化の統計分析。 画像サイズ：2.3×1.2×2mm3。 赤と青のバーはそれぞれ細動脈と細静脈の血管サイズの変化 (Δϕ) を表します。 緑色のバーは、Dex による毛細管密度の変化 (ΔD) を表します。

a、b 覚醒状態と Dex 状態の生の μODT 画像とその比率画像（c、画像サイズ：2.3 × 2 × 1.2 mm3）。 d、e 覚醒時からDex麻酔までのタイムラプス画像μODT（t）および比変化ΔμODT（画像サイズ：2.3×0.3×1.2mm3）。 f Dex による CBFv の変化。 AF: 動脈血流、VF: 静脈血流、CF: 毛細管血流。 g 動物間の覚醒状態（t：-8〜0分）とDex麻酔（t：20〜30分）の間の平均ΔCBFvの比較（p = 0.24、m = 8RoIs/動物、n = 3）。

さらに、覚醒状態からケタミン麻酔状態への移行を画像化しました。 結果は、ケタミン麻酔が一般に局所 CBFv の減少を引き起こすことを示しました。 ただし、半減時間が短いため複数回の注入が必要となり、不安定で不均一なCBFv変化が生じました（補足S3図s1）。

脳血管ネットワークに対するコカインの影響に対する、異なる麻酔薬の相互作用から生じる潜在的な交絡を調査するために、我々は、覚醒状態とDexまたはIso麻酔状態の間で、体性感覚皮質におけるCBFv応答に対するコカイン(1 mg/kg、静注)の影響を比較しました(図1)。 7）。

覚醒マウス（a-c）とDex（d-f）またはIso（g-i）麻酔マウスの感覚運動野におけるコカイン誘発性CBFv変化。 上のパネル: コカイン誘発性 CBFv 変化、μODT(t) のタイムラプス 3D μODT 画像。色分けされた数字は、対応する下のパネルにおける血流変化を追跡するために選択された位置を示します。 中央パネル: ΔμODT(t) の比率画像、画像サイズ: 2.3 × 0.3 × 1.2mm3/パネル。 下のパネル: 細動脈 (AF: 赤)、細静脈 (VF: 青)、および毛細血管 (CF: 緑) の流れネットワークにおけるコカイン誘発性の CBFv 変化。 破線の色のトレースは、コカインによる個々の細動脈 (赤)、細静脈 (青)、および毛細管 (緑) の流れの変化です。

各グループについて、フルサイズの 3D μODT 画像（2.3 × 2 × 1.2 mm3）が取得され、そこからより狭いパネル（2.3 × 0.3 × 1.2 mm3）が選択されて（補足 S4、図 S3）タイムラプスダイナミック画像が取得されました。コカインの前後で血流ネットワークが変化します (体積あたり約 1.2 分)。 覚醒状態(左パネル)とDex状態(中央パネル)の間のコカイン誘発CBFv変化の比較は、Dex麻酔下では-18.5%±4.17%、覚醒状態では-24.3%±4.76%の同様の全体的な流量減少パターンを示している。 (p = 1、n = 5 匹)。 さらに、比率画像 (b) は、おそらく麻酔状態よりも覚醒時の感覚運動野の運動活動がより高いため、CBFv の変化がより多様であることを示しました。たとえば、コカイン後のショートフローバウンスのエピソードを示しました (t = 0 分)。特に静脈の流れにおいて。 補足S6の動きアーチファクト追跡のための自己教師あり学習 図S5は、これらの一時的なCBFvエピソードと動物の動きの間の時間的相関を示しています。 興味深いことに、ΔCBFv(t) 曲線 (c) に基づくと、覚醒状態での定量化された静脈リバウンド振幅 (12.01% ± 0.75%、t = 2、8、20 分) は、Dex 状態 (4.85% ± 1.64) よりも大幅に高かった。 %、t = 9、18、23、27 分; p = 0.01)。 対照的に、Isoによるコカイン誘発CBFv減少(右パネル)は、様々な血管区画(AF、VF、およびCF)にわたって均一であり、覚醒状態(-24.3%±2.78%)よりも大きく、-33.7%±2.78%でした。 4.76％; p = 0.04、n = 5）またはDexあり（-18.5％±4.17％; p = 0.01、n = 5動物）。 全視野基底画像（補足S4図s3）と図4から、イソフルランが血管を拡張し、その結果ベースラインCBFvが約46％増加し、コカインによって引き起こされる血管収縮の検出が容易になったことは注目に値します。

ケタミン麻酔をかけた動物のコカインに対するCBFvネットワーク反応は、不均一ではあるが有意な変化は示さなかった（p = 0.57、m = 14〜16、n = 3動物）（補足S3図s2）。

さらに、覚醒している動物の脳血管ネットワークに対する慢性コカインの影響を画像化しました (n = 2)。 コカインはほぼ 3.5 日ごとに投与されました (2 × 1 mg/kg/日、2 ～ 2.5 時間間隔、iv)。つまり、25 ～ 28 日間の固定総用量のコカインの累積量は 13 mg/kg でした。 図８は、ベースライン（ａ：０日目）と慢性コカイン後（ｂ：２４日目）の間の感覚運動皮質における３Ｄ ＣＢＦｖネットワークを示す。 慢性コカイン誘発血管収縮は、CBFv の全体的な減少を示しました。 定量化により、全体的な血管収縮 Δϕ (c) は -22.3% ± 3.1% (p < 0.001、n = 5)、AF では -25% ± 13.8% (p < 0.001、n = 5)、AF では -19.8% ± 4.3% でした。 VF (p = 0.01、n = 5 匹)。 検出可能な毛細管流量密度ΔDは、フロースケルトンマップ分析に基づいて-51.7％±10％（p < 0.001、n = 5）減少しました17,44（補足S5図s4）。 全体的な CBFv 減少 (d) は -37.4% ± -4.7% (p = 0.001、n = 5) であり、このうち流量減少は -25.6% ± 9.3% (p < 0.002、n = 5)、-49.1% ± 27.3 でした。細動脈区画、細静脈区画、毛細血管区画ではそれぞれ % (p < 0.04、n = 5)、および -37.6% ± 5.5% (p < 0.001、n = 5)。 図9の詳細な3D画像分析は、慢性コカイン後の毛細管流量の減少が皮質上部層（0〜300μm）で発生したのに対し、より深い皮質層（300〜1000μm）では流量の増加が示されたことを示しました。 興味深いことに、図9b、e、hに示すように急性コカイン後のAF、VF、およびCFではCBFvが完全に減少するのとは異なり、血管適応、たとえば図9c、f、iの細動脈および細静脈樹の延長による血管の再分布が観察されました。選択された 6 つのダイビング フローで示されているように、慢性コカイン後のより深い毛細血管ネットワークでの血液供給を優先しているようです。 追加の結果は補足S8図s7に示されています。

a、b 0日目（対照）および24日目（慢性コカイン）の3D μODT画像（2.3 × 1.2 × 2 mm3）。 青い実線の点と青い破線の円は、AF または VF の流れと毛細管の流れの定量化の ROI を示します。 c、d 動脈血流（AF：赤）、静脈血流（VF：青）、および毛細管血流（CF：緑）ネットワークにおける慢性的なコカイン曝露による重大な血管収縮とCBFvの減少。

a〜c 0日目（対照）、4日目（急性コカイン）、および24日目（慢性コカイン）の上部皮質（例、L1〜L3）の3D μODT画像（2.3 × 2 × 0.3 mm3）。毛細血管CBFvの減少を示す慢性例ではベッドと拡張されたAFおよびVF枝（c）。 d〜fは皮質深部（L3〜L6以下）の対応する3DμODT画像（2.3×2×0.7mm3）であり、慢性症例（f）のAFおよびVFの枝および毛細血管床でのCBFvの増加を示しています。 g–i μODT画像の側面図。慢性的なコカイン曝露による毛細管流の再分布により、下位皮質層の奥深くまで伸びる細動脈の流れと上行する細静脈の流れを示しています。 水色の矢印は、選択した 6 つの潜行細動脈流および上行細静脈流 (i = 1, ..., 6) の深さを強調表示します。 コカインの累積投与量の合計: 急性の場合は 3 mg/kg、慢性の場合は累積投与量は 13 mg/kg。

ドップラーベースの位相検出はモーション ノイズの影響を受けやすいです。 したがって、覚醒している動物の 3D 高解像度 CBF イメージングは​​依然として技術的な課題です。 この研究では、3D µOCA および µODT 画像のモーション アーティファクトと位相ノイズを効果的に低減する深層学習フレームワークを開発し、覚醒行動の体性感覚皮質における脳微小血管系および CBFv ネットワークの高解像度イメージングに対するこの手法の有効性を実証しました。ネズミ。 この研究のイノベーションには以下が含まれます: (1) 開発および実装された自己教師あり深層学習手法 (「手法」を参照)。これは、以前の教師あり手法に比べて大きな利点があり、汎用 ODT/OCA システムおよび覚醒状態を含むさまざまな生理学的状態への適応に適しています。画像化; (2) 高忠実度 3D CBFv ネットワーク (µODT を使用) と覚醒した動物における動的変化について報告します。 (3) 覚醒動物と麻酔動物、および急性コカインへの反応における動脈、細静脈および毛細血管の流れにわたる詳細な微小血管ネットワークの動態の 3D 定量的追跡の比較。 （４）覚醒マウスにおける慢性コカイン後の血管適応（例えば、深部皮質における毛細管流量の優先的増加による皮質における全体的な流量の減少）の記録。

自己教師あり学習は、トレーニング用の「グラウンドトゥルース」として大規模なデータセットの必要性を回避できるため、動物生理学におけるシステムの変化や変動の影響を受け、通常は取得が非実用的であるμOCA/μODT画像のノイズ除去とモーションアーティファクトの除去に非常に適しています。特に覚醒した動物の研究に適しています。 たとえば、結果は、以前の教師あり学習は麻酔をかけた動物の古いOCTプラットフォームではうまく機能しました39が、覚醒している動物では皮質毛細血管ネットワークを回復できなかったのに対し、新しい自己教師あり学習は成功したことを示しています（補足S7図s6）。 。 これにより、3D CBFv ネットワークと覚醒した動物の皮質における動的変化の高忠実度 µODT イメージングが可能になります。 これは、麻酔による混乱や合併症を回避しながら、覚醒した動物のCBFvネットワーク変化に基づいて脳機能を研究するための新しいツールを提供します。 他の同様の覚醒状態の動物の血管画像研究が報告されているが45、46、47、48、それらはOCA（OCT血管造影）を増強するために適用された。 私たちの深層学習アプローチは自己監視型で、μOCA 画像のバルクモーションアーティファクトを除去するだけでなく、覚醒している動物の 3D μODT 画像のノイズも除去します。 OCT プローブの最適化と動物のトレッドミル トレーニングと組み合わせると、図 3 と図 4 に示すように、画像の忠実度が劇的に向上しました。 興味深いのは、μOCAは画像再構成に使用される取得時間が長いため、μODTよりもモーションアーチファクトの影響を受けやすいことです（補足ノートS1）。 また、μODT の検出能力、特に微小な毛細管の流れの検出能力は、覚醒している動物の微動によるバックグラウンド ノイズに非常に敏感であることにも注意してください。 したがって、毛細管の流れを強化するには、監視付きノイズ除去が必要です (図 2 および 4)。 大きなバルクモーションアーティファクトは、覚醒している動物のμODTイメージング中にも発生する可能性があり、自己教師学習ベースのノイズ除去アルゴリズムによって最小限に抑えることができます（たとえば、図7a）。 ヘッドレストの使用にかかわらず（図1など）、モーションアーティファクトとドップラー位相ノイズ（ウォッシュアウト）のため、ドップラーベースのモダリティで覚醒状態の動物の流れのイメージングを実現することは技術的に非常に困難です。 実際、我々の結果は、µODT を使用した覚醒動物の高忠実度 3D CBFv イメージング (血管造影や血管系イメージングではない) を実証しています。

μODT 画像は一般に、同じ血管に沿っても複数の明るい (高流量) スポットと暗い (低流量) スポットを示しました。 これらの明るいスポットと暗いスポットは、異なる時間に取得された図9a、bのスポットのようにほぼ再現性があり、μODT Bスキャン内の血管断面をランダムに通過する赤血球が原因である可能性は低いことを示唆しています。 代わりに、提示されたμODT画像はドップラー角θz補正されていないため（詳細については補足ノートS1）、流れに沿った明るいスポットや暗いスポットなどのアーチファクトの原因である可能性があります。 我々は、血管角度 θz を追跡するための 3D ヘシアン行列を報告しました。これにより、水平付近の流れを除いて、絶対的な CBFv 定量化のための正確な角度補正が可能になります（例、θz→900 の場合、1/cos(θz)→∞）。

一般的に使用される麻酔薬 (Iso、Dex など) がマウス皮質の脳血管系および血行動態に及ぼす影響を、覚醒状態から麻酔状態への移行時に測定しました。 Iso や Dex などの麻酔薬が脳血管系に及ぼす影響は一般的に知られています。 ここでは、μOCA/μODTの新たな進歩により、動脈、細静脈、毛細血管のコンポーネントがIsoおよびDexによってどのように影響を受けるか、それらの反応速度、それらがどのように安定/不安定になるか、およびどのように変化するかなど、より詳細な特性評価が可能になることを示しました。それらは急性コカインに対する血管および血行力学的反応に影響を与えました。 新たな進歩により、慢性コカインによる皮質の深部層と表層における血流ネットワークの変化を評価することも可能になりました。 多くの前臨床脳機能研究は麻酔下で行われており、今後も麻酔下で行われる可能性があるため、これらの結果は関連性があります。 この点において、我々の発見は、覚醒状態を最もよく模倣するコカインの脳血管への影響を研究するための麻酔薬としてのDexの使用を裏付けるものである。

3D µODT が TPM (優れた空間分解能、正確な流量測定、ただし一度に 1 つまたは非常に少数の血管に限定される) と、高速ではあるが毛細管分解能に欠けるレーザー スペックル イメージングなどの他のメゾスコピック モダリティとの間のギャップを埋めることができることは注目に値します。そして深度情報。 私たちの研究は、個々の毛細管流が非常に多様であるため、毛細管流応答の偏った定量化を回避する、高い時空間分解能と感度で、異なる皮質層にわたって神経血管相互作用を研究するためのμODTのユニークな価値を示しています。 したがって、局所的な毛細管流量の豊富な変化を追跡できることが重要です。 例えば、我々や他の研究者による以前の研究では、Iso 麻酔がニューロン活動を抑制し、脳血管を拡張させ、その結果 CBFv が増加することが実証されています 19,38,39,40。 実際、ここで我々は、細動脈および細静脈血管における劇的な血管拡張を示すが、毛細血管密度には変化がない一方、個々の毛細血管の変化は多様であるにもかかわらず、CBFvが増加する。 対照的に、Dex 麻酔では、検出可能な血管収縮はなく、全体的な CBFv の減少はわずかでした。 私たちの以前の研究では、ニューロンおよびアストロサイトの活動およびCBFv20に対するIsoの大規模な取り組みは報告されましたが、Dexの取り組みは報告されていませんでした。 我々の現在の発見は、Dex のもとで実施された脳機能研究は、イソフルランを用いた場合よりも麻酔効果によって混乱される可能性が低いというさらなる証拠を提供します 31。 また、ケタミン麻酔 (ケタミン/キシラジン (87.5 mg/kg/12.5 mg/kg カクテル、腹腔内)) も評価しました。これは、いくつかの標的の中で N-メチル-d-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体 (NMDAR) アンタゴニストとして作用します 49,50。は、覚醒状態と比較して局所CBFvの減少を示し、非常に不安定な脳血管ネットワークが観察されましたが、これは麻酔を維持するために必要なケタミンの複数回投与の影響を反映している可能性があります（補足S3）。さらに、ケタミンが脳内のドーパミンシグナル伝達を増加させるため、これは別のことを追加しますコカインや他の覚せい剤を使った研究を行うときに混乱する。

脳血管ネットワークにおける薬剤の効果を評価する際に、麻酔による交絡を評価するために、コカインを選択しました。コカインは、非常に依存性が高いだけでなく、罹患率と死亡率に寄与する脳血管への影響が主な原因となる非常に神経毒性の高い薬物でもあるからです。 実際、米国ではコカインの誤用による死亡率が劇的に増加し、2021年には24,538人が死亡すると推定されています。生体内イメージングツールを使用してコカインの前臨床モデルを研究することは、コカインの血管収縮作用の根底にあるメカニズムを特徴づけることに臨床的に関連しており、したがって介入の開発に役立ちます。それらを軽減するために。

急性コカインは、覚醒マウスおよびIso麻酔またはDex麻酔したマウスの動脈、静脈、および毛細血管ネットワークにおける全体的なCBFvを減少させたが、減少はIso下でより大きく、Dexおよび覚醒状態でも同様であった。 しかし、覚醒状態ではCBFvのショートバウンス（エピソード）が多く、これはおそらく覚醒している動物の感覚運動野におけるコカイン誘発性の運動活動に関連していると考えられる。 これは、これらの一時的なCBFvエピソードと、動きアーチファクト追跡アルゴリズムの自己教師あり学習によって評価された動物の動きとの間の時間的相関によって裏付けられました（補足S6図s5）。 これらの結果は、イソフルラン麻酔下の急性コカイン後にCBFvの大きさが減少することを示しており、これまでの報告は麻酔薬による血管拡張によって増幅された可能性があり、覚醒している動物でイメージングを行うことの重要性を強調している。

最後に、コカインの脳血管への影響に対するケタミンの影響を評価しました。 ケタミンはコカインと同様、脳内のドーパミンを増加させ、コカインの薬理効果を評価する研究を混乱させる可能性のある他の脳機能への影響を及ぼします。 具体的には、(1) それは、局所 CBF、領域間接続パターン、およびグルタミン酸代謝の変化を誘発します 51、(2) コカインの効果の標的である線条体ドーパミン輸送体の利用可能性を変化させます 52、(3) コカインの神経内分泌および行動への影響を阻害します。コカイン投与 53、(4) 腹側被蓋野のドーパミンニューロンの脱抑制による強化をサポートします 54。 定量分析では、ケタミン麻酔下でのコカイン後のCBFvの明らかな変化は示されませんでした（補足S3）。

以前の前臨床研究では、血管収縮や虚血を含む慢性コカインによる神経毒性影響が記録されています 16、17、27、55。 これらの画像研究のほとんどは麻酔下（イソフルランなど）で実施されており、コカインの長期血管収縮効果を損なう可能性のあるイソ血管拡張などの所見を混乱させた可能性がある。 慢性頭蓋窓移植手術と深層学習ベースのモーションアーチファクト/ノイズキャンセリング技術のおかげで、覚醒行動している動物の慢性コカイン曝露に起因する脳血管変化を詳細に追跡できるようになり、麻酔誘発性の交絡アーチファクトを排除できるようになりました。 私たちの発見は、慢性的なコカインへの曝露後の覚醒した動物の皮質における顕著な脳血管機能低下を記録しており、これは、私たちのグループや他のグループによって報告されているように、コカイン曝露による虚血や脳卒中に対する脆弱性の根底にある可能性があります。 また、3D μODT画像（図8、9）に基づいて、慢性コカイン動物における毛細血管CBFvの減少は、主に上部皮質層I〜III（たとえば、0〜300μm）で発生しているのに対し、浸透する細動脈および静脈血流は拡張していることに気づきました。より深い皮質層（例、300～780 μm）まで浸透し、おそらく全体的な低灌流脳の皮質活動を維持するために、これらの層での血液灌流を優先する可能性があります。 皮質層間の慢性コカインに対するこのような異なる反応の根底にあるメカニズムは不明であるが、さまざまな皮質領域にわたる流れまたは活動の調節におけるドーパミンと他の神経伝達物質および受容体（例えばノルアドレナリン）との間の違いを反映している可能性がある56、57、58。 神経-アストログリオ-血管相互作用の変化など、これらの現象の根底にあるメカニズムを理解するには、血管力学および関連する神経生理学に関するさらなる研究が必要です。 比較的少量から中程度の用量のコカインを繰り返し投与した後（例えば、25日間にわたる総量13 mg/kgのコカイン）、重度の脳血管機能低下が観察されたことに留意すべきである。 したがって、動物に最大 45 mg/kg/日のコカインを投与するコカイン自己投与のロングアクセス モデルをテストした場合、神経毒性がはるかに壊滅的なものになる可能性があると予想するのは合理的です55。

この研究の限界は、細胞機能の変化（例えば、ニューロンおよびアストロサイトの活動）が同時に記録されないことであり、そうでなければ、覚醒状態と麻酔状態の間の感覚および運動関連の神経活動の違いを特徴付けることができた可能性がある。 したがって、ニューロン活動の変化（例えば、感覚関連神経活動と運動関連神経活動）に起因する変化を、麻酔効果またはコカインとの相互作用のいずれかの直接的な脳血管効果を反映する変化から分離することはできません。 もう 1 つの制限は、画像取得中に動物の生理学的安定性が十分に維持されていたにもかかわらず、麻酔の深さを測定しなかったことです。 さらに、血管収縮や血管拡張とは異なり、毛細血管網への影響は毛細血管密度の変化 (フィルファクターなど) として定量化されました。

要約すると、我々は、覚醒している動物の 3D 高解像度脳血管イメージングに合わせた革新的な自己教師あり深層学習ベースの µOCA/µODT 技術を開発しました。 覚醒している動物の機能的脳イメージングにおけるこの技術の可能性を実証するために、我々はこの技術を適用して、コカインに応答した脳血行動態（CBFv）に対する麻酔薬交絡の潜在的な混乱を文書化しました。 麻酔薬とコカインの薬理効果との間の重要な相互作用を文書化した我々の研究結果は、臨床的に関連する可能性がある。 たとえば、前臨床および臨床研究では、コカインの毒性効果は、麻酔効果のあるアルコール 59 によって増強されることが報告されており 60,61 、したがって、毒性の増強はそのような相互作用を反映している可能性があります。 私たちの発見は、麻酔下で行われたコカインの前臨床神経画像研究を解釈するのに役立ち、覚醒した動物で研究を行うことができない場合の麻酔薬の選択に関する将来の研究に情報を提供するのにも役立ちます。 私たちの研究はまた、覚醒した動物における薬物の薬理効果を測定するために使用できる深層学習で強化された画像処理技術の使用を含む、神経画像ツールの進歩にも貢献します。 さらに、高度な自己教師あり学習を適用することで、効果的にノイズを除去し、動作アーチファクトを最小限に抑えることができ、さらに重要なことに、運動活動に関連する覚醒した動物の動作/動きを監視することができます。 このアプローチは、覚醒した動物モデルにおける一過性脳虚血発作やそれに伴う麻痺などの慢性コカイン誘発性脳血管病理の研究に使用でき、それによりその予防と治療方法の理解を進めるのに役立つ62,63。

生後6〜8週齢のC57BLマウス（Jackson Laboratory）を使用した。 合計 29 匹のマウスを使用して 53 回のイメージング実験を実施しました。そのうち、ベースライン研究として麻酔状態と覚醒状態の間の流れの違いを特徴付けるために 26 回の実験で 13 匹のマウスが使用され、急性/慢性状態にアクセスするために 27 回の実験で 16 匹のマウスが使用されました。脳機能研究技術の一例として、コカインの脳血流への影響。 補足S2 表s1は、麻酔状態と覚醒状態の間のCBFvの違いを比較するための動物グループの実験の詳細と、皮質CBFvネットワークに対するコカインの影響を研究するための実験の詳細をまとめています。 すべての実験手順はストーニー ブルック大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、国立衛生研究所 (NIH) の実験動物の管理と使用のガイドラインに従って実施されました。

各マウスの皮質に頭蓋窓を移植するため、純粋な O2 を混合した吸入イソフルラン (導入用に 4%、維持用に 1 ～ 2%) で麻酔した後、マウスの頭を定位フレームにしっかりと固定し、体温を維持しました。約37℃、感覚運動皮質領域上の約3×4 mm2の慢性頭蓋窓（A/P-2.0、M/L-2.0）を注意深く開けた。 露出した皮質表面をすぐに 2% アガロースゲルで湿らせ、最初に生体適合性シアノアクリル酸接着剤を塗布し、次に歯科用セメント (MIA622、HE Parmer Co.) をカバースリップの端に塗布して厚さ 160 μm のカバーガラスでしっかりと固定しました。頭蓋骨との結合により、脳が確実に固定され、覚醒時イメージング中の動作アーチファクトが最小限に抑えられます。 4 つのマイクロネジ (MX-0090-01SP、Component Supply Co.) を使用して金属製ヘッド プレートを頭蓋窓の上の周囲の頭蓋骨に固定し、歯科用セメント (MIA622、HE Parmer Co. Inc.) で固定しました。 頭蓋窓周囲の創傷を縫合し、滅菌し、長期の光学的クリアランスを確保するためにマウスに抗生物質および抗炎症処置（必要に応じて）を施した。 実験中、心電図検査（ECG）、呼吸数、体温などのマウスの生理学的状態を継続的にモニタリングしました（SA Instruments、ニューヨーク州）。 すべての手順は、生存手術のための滅菌ガイドラインに従って行われました。

カスタムの空気膨張齧歯動物移動ケージ (トレッドミル) を使用して、頭を固定したマウスを訓練し、意識のある動物の脳イメージングのための動作アーティファクトを軽減しました 30。 剛性の超軽量カーボンファイバーシートで作られた円筒形の可動ケージ（例：φ24 mm × 8 mm）を、空気で膨張させたテーブル（例：φ380 mm）上に約 0.8 mm 浮かせて、任意の水平方向に自由に移動できるようにしました。ネズミが歩いたり走ったりしようとした。 可動ケージは、脳機能の動きのない光学イメージングのために動物の頭を静止させながら、自由に走っているような錯覚を生み出しました。 しかし、頭部固定はストレスを誘発し、神経生理学的研究に交絡的な影響を引き起こす可能性があり、脳の微細運動により光学画像検出が損なわれる可能性があります。 動物を頭部固定イメージング手順に慣れさせ、動きアーチファクトを最小限に抑えるために、覚醒イメージングセッションと同じ条件下で動物を訓練した。 複数のトレーニング セッションを延長した 3 日間のトレーニングを採用しました。その間、マウスは空気で膨張させた移動ケージの上に立ったまま頭を固定し、セッションあたりのトレーニング時間を 10 分から 30 分、60 分と徐々に増やし、トレーニング セッションを増やしました。 1 日目の 1 セッションから 3 日目の 3 セッションまで。周囲の視覚および聴覚刺激からの干渉を最小限に抑えるために、マウスの頭の周囲の領域を黒い布で覆い64、トレーニング中の発声と動作の発生によってストレスの兆候を監視しました。セッション65、66。 動物の準備、訓練、および in vivo イメージングの動物プロトコールは、ストーニー ブルック大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、国立衛生研究所 (NIH) の実験動物の管理および使用に関するガイドラインに従っています。

麻酔をかけたマウスまたは覚醒行動しているマウスの感覚運動野における微小血管系および脳血流速度 (CBFv) ネットワークの in vivo 3D イメージングを、超広帯域光源を備えたカスタムの超高解像度光コヒーレンストモグラフィー (μOCT) セットアップで実行しました。 (I = 8mw; λ = 1310 nm、ΔλFWHM ≈ 200 nm) は、生物組織内で 2.5 μm の軸分解能を達成できる 2 × 2 波長平坦化光ファイバーマイケルソン干渉計を照明しました (つまり、コヒーレンス長 Lc = 2(ln2) 1/2/π・λ2/ΔλFWHM)。 サンプルアームから出た光はΦ3〜4 mmにコリメートされ、サーボミラーによって横方向にスキャンされ、NIRアクロマティックダブレット（f18 mm / NA 0.25、Edmond Optics）によってマウスの感覚運動皮質上の慢性頭蓋窓を通して集束され、最大横方向解像度は 3.2 μm。 サンプルと参照アームから戻った光は検出ファイバー内で再結合され、カスタム分光計によってコリメートおよび線形回折され、2k ピクセルのラインスキャン InGaAs カメラ (2048 R、センサー無制限) によって最大 147k A ライン/ラインで検出されました。 s. CBFv ネットワークの正面最大強度投影 (MIP) は、グラフィック プロセッシング ユニット (GPU) によって強化されたカスタム GUI プログラミングによって瞬時に再構築され、たとえば断面あたり 2 M ピクセルまたは B- 473fps の速度でスキャンします。 マウス皮質の微小血管系（μOCA）およびCBFv（μODT）ネットワークの3D画像は、それぞれスペックル分散分析および位相サブトラクション法によって再構築されました11、13、15（詳細については補足ノートS1）。

覚醒している動物の 3D µOCA/µODT イメージングに重要なモーション アーティファクトを最小限に抑えるために、サンプル アーム内の光路の短縮、成形機械光学の使用、およびサンプル アームを相互接続する剛性 Ti 移行プレートの設計など、OCT スキャナーの修正が実施されました。マウス頭蓋窓と OCT プローブ。 さらに、画像取得パラダイムが最適化され、たとえば、µOCA では反復 B スキャンを 4 フレームから 14 フレームに増加し、フルフィールド µODT では A スキャン ポイントを 10k に減らして A スキャン レートを 8 kHz に増加して、モーション ノイズを効果的に除去しました。画像後処理を介して。

イメージング中に覚醒状態から麻酔状態に切り替えるために、マウスに 2.0 ～ 2.5% イソフルラン (Iso) の吸入またはデクスメデトミジン (Dex、0.025 mg/kg、腹腔内) の腹腔内注射を介して麻酔をかけました。 麻酔が維持されていることは、疼痛反応の欠如と呼吸数の安定によって確認されました (小動物計器、モデル 1025 L)。 覚醒状態と麻酔状態（例、Iso、Dex）の間でコカイン誘発性の血行力学的変化（例、血管収縮または拡張、CBFv変化）を比較するために、尾静脈注射（1 mg/kg、iv）によりコカインを投与した。 比較のために、87.5 mg/kg ケタミンと 12.5 mg/kg キシラジンのカクテルを含む麻酔薬としてのケタミンを投与 (腹腔内) して、イメージング中に覚醒状態から麻酔状態に切り替え、またコカイン誘発性 CBFv 変化を追跡しました。動物の皮質。 詳細な実験手順は補足S3で説明されています。

3D μODT および μOCA は、2 つの隣接する A スキャン間の位相差から流速 (ドップラー周波数シフト ν) を導出する位相減算法と、隣接する B スキャン間のスペックル分散 (つまり、正規化された標準偏差) を計算することによって再構築されました。それぞれ（補足S1）。 μODT は動脈血流と静脈血流を識別するために使用されました 16。 簡単に言うと、ドップラー流速 ν は、流れの方向または位相差と流れ角度 θz の積として (+/-) 割り当てられます (つまり、cosθz 00 ～ 900 の場合は「+」、900 ～ 1800 の場合は「-」)。 したがって、θz を追跡するためにヘシアン行列を適用することにより、血管に沿った流れの方向を決定できます。 大きな血管ツリーの流れの方向が枝に向かう場合 (たとえば、枝分かれしている場合)、それは動脈/細動脈です。 分岐の流れ方向がより大きな血管に合流する場合 (例、分岐)、それは静脈/細静脈です 16。

バルクモーション（動物の動きなど）によって引き起こされるμOCAのアーティファクトは、縞模様のモーションアーティファクトを増加させる傾向があります。 したがって、特に覚醒している動物のイメージングでは、微小血管系の正確な検出を可能にするために、動きアーチファクトの抑制が重要です。 ここでは、これを組み合わせたアプローチによって実装しました。 モーションアーティファクトにより、瞬間的なドリフトやジッタリングにより複数の B スキャン間で実質的な非相関が生じるため、追加の B スキャン (例: N = 14) が取得され、その中で最も相関性の高い B スキャン (例: N' = 6、rCorr) > 0.9）は、モーションアーチファクトを抑制するための前処理のためのスペックル分散アルゴリズムを介してμOCAのBスキャンを再構築するために選択されました（補足ノートS1）。

Bスキャンの前処理により、中程度の動きに起因するほとんどの動きアーティファクトを修正できましたが、激しい動きから生じるいくつかの大きくて扱いにくい縞状のノイズが残り、多くの場合、複数の隣接するBスキャンにまたがりました（図2a）。 運動アーティファクトをさらに抑制するために、勾配ベースの方法、たとえば最適配向フラックスを使用して、脳血管ネットワークの初期バイナリセグメンテーションが生成されました 44,67。 縞模様のノイズによって崩れた B スキャンが識別できたため、そのような縞模様が最初に除去され、次にその領域が効果的な深層学習ベースの構造認識修復モデルによって復元されました。このモデルは、除去された領域の血管マスクを埋めるように設計されました。ベッセルネス領域40,44。 より具体的には、このモデルは、元のストライプ領域の画像勾配の観点から血管構造情報を統合し、修復プロセスをガイドします。これは、修復用の GatedConv モジュールを備えたデコーダ/エンコーダ アーキテクチャに従っています41。 このような構造情報は、既存の手法では無視されていた追加の手がかりをもたらし、特にこれらの手法にとって大きな課題となっていた幅広のストライプの修復モデルの堅牢性を高めました。 さらに、透明領域の構造情報は、自己教師ありの方法でモデルをトレーニングするために最大限に活用され、コストのかかる手動アノテーションの必要性を回避しました。 詳細については、自己教師あり学習モデルの図を図 10a に示します。 モーションアーティファクトのない二値化血管ネスマスク（たとえば、図2b）が生成された後、入力MIP μOCA画像と乗算されて、マウスの脳内のモーションアーティファクトのない3D微小血管ネットワークを示す強化されたμOCA画像が提供されました（例えば、図２ｃ）。 二値化マスク図2bは、補足S5図s4に示すように、毛細管流量密度（CD）を計算するためにも使用されました。

動きによって引き起こされるノイズパターン（すなわち、緑色の矢印）を学習し、ノイズおよびアーティファクト（たとえば、赤色の矢印）を効果的に低減するための自己教師あり深層学習モデルのフローチャート。 BMA: バルク モーション アーティファクト。 CNN:畳み込みニューラル ネットワーク。 b 元のボリューム内のバックグラウンドノイズ（例えば、赤い矢印）を抑制するための血管の不変特徴（例えば、緑の矢印）を学習するための自己教師あり3D μODT強化モデルのフローチャート。

一方、自己教師あり学習モデルは、3D µODT ボリュームの微小血管の流れを強化するために導出され、強度リマッピング (IR) および血管クロッピング (VC) モジュールから不変の血管特徴を学習しました。 データ分布の統計に基づいて、IR モジュールは、不変の強度特徴の学習をガイドするために、さまざまな強度の血管を生成しました。 さらに、VC モジュールは、予測の血管系接続を促進するために使用されました。 具体的には、血管の一部のセグメントをランダムにドロップし、削除されたセグメントを復元することで血管の特徴を学習するモデルをトレーニングしました。 したがって、私たちのモデルは画像のコントラストを改善しただけでなく、血管の接続性も強化しました。 他の自己教師あり手法と比較して、私たちのモデルは鮮明な画像/ノイズのある画像、またはノイズのある画像/ノイズのある画像のペアを必要としないため、μODT 関連の生物医学アプリケーションにおいてより実用的です。 図10bに示すように、UNetスタイルの3D CNNがバックボーンとして使用されました。 トレーニングが収束した後、私たちのモデルは、ノイズの多いμODTボリュームを効果的に強化されたμODTボリュームに直接変換しました（たとえば、図2d、eから。モーションアーティファクトの除去に加えて、自己トレーニング方法は背景ノイズを効果的に抑制し、画像のコントラストを改善しました） 、低 SNR 領域の弱い毛細管フロー ネットワークを強化します。

CBFv を定量化し、その差異を比較するために、各動物で各血管タイプにつきおよそ 4 ～ 6 個の血管を選択し、流量変化をサンプリングし、その平均値と標準誤差を計算しました。サンプリング スポット (例、i = 1、…、 6) 対応するトレースは、動脈、静脈、毛細管の流れについてそれぞれ赤、青、緑で強調表示されました。 微小血管ネットワークの変化（例、血管拡張または血管収縮）は、それらの相対変化、すなわちΔϕ=(ϕ-ϕ0)/ϕ0として表され、ここでϕ0はベースラインの血管サイズを指します。 同様に、μODT によって測定された血流の変化は、ΔCBFv = (CBFv – CBFv0)/CBFv0 として表されます。ここで、CBFv0 は、対応するベースライン流量を指します。

統計テストは SYSTAT ソフトウェア (米国イリノイ州シカゴ) を使用して実行されました。 覚醒状態と麻酔状態（ISO、DEXなど）の間、およびベースラインとコカイン注射後のCBFvおよび血管直径の差を、両側t検定または順位和検定によって検定しました。 CBFvの変化、血管収縮、または拡張は、一元配置反復測定ANOVAとその後の事後検定（Holm-Sidak法）を使用して有意差について検定されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、NS は有意でないことを示します。 すべてのデータは、変化率の平均 ± 標準として表示されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で提示されたすべてのソース データセットは、補足データ 1 および 2 ファイルに含まれています。 特に大規模な未加工 3D 画像の追加データは、合理的な要求に応じて対応する作成者から入手できます。

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この研究は、国立衛生研究所からの助成金 2R01DA029718 (CD、YP) および 1RF1DA048808 (YP、CD) によって部分的に支援されました。

ストーニーブルック大学生物医工学部、ストーニーブルック、ニューヨーク、11794、米国

インティアン・パン、キチョン公園、Congwu Du

ストーニー ブルック大学コンピューター サイエンス学部、ストーニー ブルック、ニューヨーク、11794、米国

レン・ジアシアン＆リン・ハイビン

国立アルコール乱用およびアルコール依存症研究所、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、20857、米国

ノーラ・D・ヴォルコウ

国立神経障害・脳卒中研究所、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、20892、米国

アラン・P・コレツキー

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CD、NDV、YP が調査を設計しました。 KP は in vivo 実験とデータ分析を実施しました。 JR と HL は自己教師あり学習ベースの画像処理を実施しました (KP と JR は同等に貢献しました)。 YP、CD、NVD、および AK は、データの解釈、結果の議論、および原稿の執筆に貢献しました。

インティアン・パンへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Chao Zhou と Manuel Breuer。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Pan, Y.、Park, K.、Ren, J. 他自己教師あり学習強化型光コヒーレンスドップラー断層撮影法を使用した、覚醒マウスの脳血流の動的3Dイメージング。 Commun Biol 6、298 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04656-x

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受信日: 2022 年 5 月 5 日

受理日: 2023 年 3 月 3 日

公開日: 2023 年 3 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04656-x

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